结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，大量证据表明，饮食、吸烟、肥胖和运动等生活习惯均与CRC的发病密切相关。
吸烟不仅会提高肺癌发病风险，也会促使结肠、肾脏和胰腺等器官发生癌变。研究表明， 吸烟会显著增加人类结直肠癌的发病率和死亡率，在动物模型中也观察到吸烟会增加结直肠癌发病的风险。
那么一个非常直接的问题，吸烟究竟是如何促进CRC发生和发展的呢？这个目前尚不明了。
近日，由 香港中文大学于君领衔的研究团队，在 Gut 上发表重要研究成果[1]。
她们发现 吸烟导致肠道菌群及其代谢物的组成发生改变，导致肠道屏障功能障碍和致瘤、促炎信号通路的激活，从而促进结直肠肿瘤的发生。
她们的研究提示，控制肠菌可能是一种预防吸烟人群患结直肠癌的潜在策略。
论文首页截图
吸烟与CRC的发病率和死亡率密切相关，探索其中的发生机制十分必要。
一方面，研究表明，吸烟会增加人肠道中细菌的多样性[2, 3]，改变肠道菌群和粘蛋白结构[4]；另一方面，现有研究已证实了肠道菌群的改变与结直肠癌的发生存在相关性[5]，CRC患者来源的肠道菌群会促进受体小鼠发生结肠癌。
但是肠道菌群的改变是否代表着吸烟与结直肠癌的联系，目前并不清楚。
为了理清这一关系，于君教授团队将偶氮甲烷（AOM）处理的C57BL/6小鼠每天分别在清洁空气或香烟烟雾中暴露2小时，28周后，利用鸟枪法宏基因组测序和液相色谱-质谱法分析小鼠粪便中微生物和代谢产物的变化。
实验造模流程图
我们知道腹腔注射AOM会诱导小鼠发生CRC，那么暴露在两种不同空气环境下小鼠的CRC发生情况是否会有不同？
研究结果显示，与对照组的小鼠相比， 暴露在香烟烟雾中小鼠的结直肠肿瘤数目和大小显著提高；而且免疫组化和蛋白质印迹均显示肠道上皮中Ki67+细胞比例明显增加，这意味着 香烟烟雾的暴露促进了小鼠结肠上皮细胞的增殖。
香烟烟雾促进了小鼠结肠癌的发生
接着，研究人员利用鸟枪法宏基因组测序对两组小鼠的粪便微生物组进行分析， 她们发现，经过为期28周的处理后， 香烟暴露组小鼠肠道菌群的alpha多样性明显降低，beta多样性聚类存在显著差异。
香烟烟雾调节小鼠肠道菌群
相对对照组小鼠来说，暴露在香烟烟雾的小鼠中有20种细菌发生了明显改变（p<0.05, FC>1.5），其中 Eggerthella. lenta 和 Staphylococcus capitis 显著富集，肠道益生菌 Lactobacillus reuteri， Parabacteroides distasonis 和 Bacteroides dorei 减少。此外， 她们还发现两组小鼠肠道菌群的关联性发生显著变化，在 香烟烟雾暴露组的小鼠中， E. lenta 与几种益生菌的丰度呈现负相关，即伴随着 E. lenta 的富集，几种益生菌的丰度明显降低 。
除了测序，研究人员还通过液相色谱-质谱法分析了小鼠的粪便代谢物，结果发现两组小鼠的粪便代谢物具有显著差异，有41种代谢物发生了改变（p<0.05），主要富集在胆汁酸代谢通路中，其中 牛磺脱氧胆酸（TDCA）的含量在香烟暴露小鼠中明显增高，TDCA是次级胆汁酸中公认的致癌物。
那么在香烟暴露组中，发生改变的肠道菌群跟粪便代谢物之间存在哪些关联呢？通过相关性分析，研究人员发现 E. lenta 与TDCA呈现最强的正相关，而两种减少的益生菌 Lactobacillus jensenii ， Lactobacillus crispatus 与TDCA则呈现负相关。因此， 失调的肠道菌群及其代谢物很可能是小鼠发生CRC的重要推手。
肠道细菌与差异代谢物的部分Spearman相关性分析
接着研究团队研究了香烟烟雾对小鼠肠道屏障功能的影响， 她们检测了结肠紧密连接蛋白的表达水平，发现香烟烟雾明显降低了claudin-3和闭锁小带-1（ZO-1）的表达水平；另外，血清中脂多糖（LPS）水平显著提高。这些结果表明 香烟烟雾会导致肠道屏障功能受损。
香烟烟雾降低了claudin-3和ZO-1的表达
为了从分子角度了解吸烟对原癌形成的影响，于君研究团队对小鼠肠道上皮细胞进行基因检测，与未吸烟组相比， 香烟暴露组的小鼠肠道上皮细胞有19个基因上调，7个基因下调。富集结果显示，变化基因主要富集在丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路。
既往文献报道TDCA可以激活MAPK通路的ERK亚家族，所以研究团队评估了两组小鼠肠道上皮中MAPK/ERK通路的激活情况。ERK1/2是MAPK/ERK通路中关键的调节蛋白，研究人员发现香烟烟雾能够提高ERK1/2的磷酸化水平，且磷酸化的ERK1/2与TDCA呈正相关。以上结果提示 香烟烟雾会诱导ERK1/2发生磷酸化，激活MAPK/ERK通路，从而促使结肠癌的发生。
随后，为明确炎症相关基因表达的变化，于君团队检测了两组小鼠肠道上皮细胞的炎症和自免相关基因表达情况。结果发现，两组的差异基因主要富集在白介素17（IL-17）和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路。qPCR结果验证了 香烟暴露组中促炎因子Il17a和Cxcl2转录水平的增加以及抑炎因子Il10的降低。这提示了 香烟烟雾促进了结肠中炎症的发生。
小鼠肠道上皮细胞的两种芯片检测基因表达结果
为了证实香烟烟雾引起的肠道菌群改变对结直肠肿瘤发生的直接作用， 她们对无菌小鼠进行了粪便菌群移植，将未吸烟组（GF-AOM）和香烟暴露组（GF-AOMS）小鼠的粪便分别移植到小鼠结肠部位。
与之前结果类似，GF-AOMS肠道菌群的alpha多样性明显降低，beta多样性分析显示与GF-AOM小鼠有显著分离； E. lenta 仍然是在GF-AOMS中丰度最高的细菌，TDCA含量也显著增高。此外在GF-AOMS中， 香烟烟雾组来源的微生物群同样增加了结肠细胞增殖，损害了肠道屏障功能，增强了致癌信号通路MAPK/ERK和促炎基因的表达。因此，肠道菌群的改变有助于香烟烟雾在结直肠癌发生中的促肿瘤作用。
机制示意图
总的来说，此研究发现吸烟可通过调节肠道菌群组成，诱导肠道菌群失调，促进结肠肿瘤的发生；代谢方面吸烟明显促进TDCA的生物合成，其与肠道中E. lenta细菌呈显著正相关；吸烟会损害肠道屏障，激活致瘤性MAPK/ERK信号通路。
本研究 首次建立了一种新型的肠道微生物介导的香烟烟雾致结直肠肿瘤发生机制，这提示我们，戒烟至少是通过重建健康的肠道微生物群来预防结直肠癌的可行方法之一。
参考文献：
[2]. Biedermann L, Zeitz J, Mwinyi J, et al. Smoking cessation induces profound changes in the composition of the intestinal microbiota in humans. PLoS One. 2013;8(3):e59260. doi:10.1371/journal.pone.0059260
[3]. Biedermann L, Brülisauer K, Zeitz J, et al. Smoking cessation alters intestinal microbiota: insights from quantitative investigations on human fecal samples using FISH. Inflamm Bowel Dis. 2014;20(9):1496-1501. doi:10.1097/MIB.0000000000000129
[4]. Allais L, Kerckhof FM, Verschuere S, et al. Chronic cigarette smoke exposure induces microbial and inflammatory shifts and mucin changes in the murine gut. Environ Microbiol. 2016;18(5):1352-1363. doi:10.1111/1462-2920.12934
